Thạch TSI agar (Triple sugar iron agar) (1039150500) được sử dụng để xác định các vi khuẩn bacillus gram âm có lên men glucose và lactose hoặc sucrose và có sản xuất hydrogen sulfide (H₂S) hay không. Nó chứa 10 phần lactose: 10 phần sucrose: 1 phần glucose và peptone. Phenol red và sắt sunfat được sử dụng như là một chất chỉ thị cho sự axit hóa môi trường và sự xuất hiện H₂S.

Đầu tiên vi sinh vật sẽ sử dụng Glucose để lên men nên khiến toàn bộ môi trường trở nên axit (màu vàng) trong khoảng 8-12 giờ. Phần gốc vẫn giữ trạng thái axit thậm chí sau khi ủ khoảng 18-24 giờ bởi vì sự có mặt axit hữu cơ từ việc lên men glucose dưới điều kiện kỵ khí trong phần đáy ống. Mặt nghiêng của môi trường trở về trạng thái kiềm, được chỉ thị bằng màu đỏ vì các sản phẩm lên men bị oxy hóa thành CO₂ và H₂O và peptone trong điều kiện hiếu khí, phần mặt nghiêng trải qua oxy hóa giải phóng các amine kiềm (Phenol đỏ trong pH kiềm trở thành màu đỏ trong khi trong điều kiện pH axit sẽ có màu vàng).

• Nếu sinh vật lên men glucose nhưng lại không lên men lactose và/hoặc sucrose, sau đó mặt nghiêng sẽ trở thành màu đỏ và phần gốc vẫn màu vàng (K/A) trong khoảng 18 đến 24 giờ.
• Nếu bên cạnh việc lên men glucose sinh vật còn lên men lactose và/ hoặc sucrose, sản phẩm lên men được hình thành trên mặt nghiêng sẽ trung hòa hơn amine kiềm chuyển mặt nghiêng thành axit (màu vàng) (A/A), hiện tượng này sẽ xuất hiện sau khoảng 18 tới 24 giờ.
• Nếu sinh vật không phải dạng lên men, thay vì sử dụng đường, nó sẽ sử dụng pepton như một nguồn năng lượng thay thế dưới điều kiện hiếu khí trên mặt nghiêng, việc này khiến trở nên kiềm được chỉ thị bởi mà đỏ trong khi không có sự thay đổi màu sắc của gốc. K/NC

Các phản ứng trong môi trường thạch TSI agar không nên đọc sau ủ 24 giờ, bởi vì sự oxy hóa hiếu khí các sản phẩm lên men từ lactose và/ hoặc sucrose sẽ xuất hiện và mặt nghiêng cuối cùng chuyển thành trạng thái kiềm.

Sự hình thành CO₂ và H₂ được chỉ thị bởi sự có mặt của các bóng hoặc vết nứt trong môi trường hoặc bởi sự tách thạch khỏi thành hoặc đáy ống. Sự hình thành H₂S chuyển thành điều kiện axit và được chỉ ra bởi đen phàn gốc của môi trường trong ống.

Quy trình:

1. Dùng que cấy vi khuẩn tiệt trùng chạm vào khuẩn lạc đã được phân lập.
2. Cắm que cấy khuẩn vào tâm môi trường thạch TSI agar ở đáy ống và sau đó chang trên mặt nghiêng.
3. Đậy lỏng nắp và ủ ở nhiệt độ 35 độ C trong không khí trong vòng từ 18 tới 24 giờ.
4. Quan sát phản ứng

Kết quả:

• Mặt nghiên kiềm/ không thay đổi trong phần gốc (K/NC) hoặc mặt nghiêng kiềm/ gốc kiềm (K/K) = sinh vật không lên men glucose, lactose và sucrose. (red/red)

• Mặt nghiêng kiềm/ gốc axit (K/A)- sinh vật chỉ lên men glucose. (red/yellow)

• Mặt nghiêng axit/ gốc axit (A/A)- sinh vật lên men glucose, lactose và/hoặc sucrose (yellow/yellow)

• Một sự kết tủa màu đen trong phần gốc chỉ ra sự sản sinh H₂S . H₂S được tạo ra phản ứng với muối sắt để tạo ra sắt sunfit kết tủa màu đen.
• Bóng khí hoặc vết rạn nứt trong ống chỉ ra sự sản xuất CO₂ hoặc H_2. Vòng tròn xung quanh gốc chỉ ra rằng khí được sản xuất bởi sinh vật lên men bởi glucose và sucrose hoặc lên men glucose và lactose và sucrose, hoặc lên men sucrose và lactose.